国产主播欧美精品,在线视频cao,中文字幕免费一区二区,日韩三级影视

預存
Document
當前位置:文庫百科 ? 文章詳情
?細胞熱遷移分析技術cetsa的具體原理和實驗流程
來源: 時間:2024-11-29 11:29:19 瀏覽:8163次

?細胞熱遷移分析技術cetsa的具體原理和實驗流程

 

一、基本原理

細胞熱遷移分析技術(Cellular Thermal Shift Assay,CETSA是一種用于檢測細胞內藥物與靶蛋白結合效率的實驗技術,其基本原理是基于蛋白質的熱穩定性;在細胞內,當藥物與靶蛋白結合時,靶蛋白的結構會變得更加穩定,從而在升高的溫度下不易發生變性,因此,與未結合藥物的蛋白相比,結合了藥物的蛋白在相同的溫度下會有更多的未降解蛋白;這一現象可以通過測量不同溫度下的蛋白降解情況來觀察,通常使用免疫印跡(Western blotting質譜(MS等方法進行檢測。

二、實驗流程

1. 細胞準備

細胞培養:選擇合適的細胞系,如HEK 293T細胞,進行培養;確保細胞處于良好的生長狀態。

轉染:如果需要,將構建好的質粒瞬時轉染到細胞中,以便在細胞內表達特定的蛋白;通常使用脂質體轉染試劑,按照制造商的方案進行操作。

藥物處理:將細胞暴露于DMSO(對照組)或待測試的藥物中,孵育一定時間(例如24小時),以確保藥物充分與靶蛋白結合。

2. 細胞裂解

洗滌:收集細胞,用含有蛋白酶抑制劑(如1 mmol/L PMSF50×cocktail)的PBS洗滌細胞,以防止蛋白降解。

重懸:將細胞重懸于PBS中,調整細胞密度至2×10^7 cells/ml。

3. 溫度梯度處理

分裝:將細胞分裝到多個PCR管中,每管含有相同數量的細胞。

加熱:將PCR管置于熱循環器中,在不同的溫度(例如37℃至67℃)下加熱3分鐘,使蛋白質變性;每個溫度點設置至少三個重復樣本,以確保結果的可靠性。

4. 細胞裂解和凍融

裂解:將加熱后的細胞重懸于NP40緩沖液中,用液氮進行3次凍融循環,以徹底裂解細胞。

離心:將裂解后的細胞懸液在4℃、20,000×g離心20分鐘,收集上清液;上清液中含有未降解的蛋白,而沉淀物中則是已經降解的蛋白。

5. 蛋白檢測

Western blotting:取20 μL上清液,加入等量的2×SDS loading buffer,沸水浴中滅活10分鐘然后進行SDS-PAGE電泳,轉移到PVDF膜上,用特異性抗體進行免疫印跡,檢測目標蛋白的表達量。

質譜分析:如果需要進行高通量檢測,可以將上清液送至質譜公司進行蛋白質譜分析,以獲得更詳細的蛋白信息。

三、應用

1. 藥物靶點驗證

藥物結合:CETSA可以驗證藥物是否與預期的靶蛋白結合,通過比較藥物處理組和對照組的蛋白降解情況,可以確定藥物與靶蛋白的結合效率。

脫靶效應:CETSA還可以用于檢測藥物的脫靶效應,即藥物是否與非預期的蛋白結合;這有助于評估藥物的安全性和特異性。

2. 蛋白-蛋白相互作用

相互作用驗證:CETSA可以用于研究細胞內蛋白-蛋白相互作用,通過觀察不同溫度下蛋白的降解情況,可以判斷兩種蛋白是否發生相互作用。

相互作用強度:CETSA還可以提供關于蛋白-蛋白相互作用強度的信息,這對于理解生物過程中的調控機制非常重要。

3. 藥物篩選

高通量篩選:結合質譜技術(MS-CETSA),CETSA可以用于高通量篩選潛在的藥物候選物;通過大規模的溫度梯度實驗,可以快速鑒定出與目標蛋白結合的化合物。

四、局限性

盡管CETSA技術具有許多優點,但也存在一些局限性:

靈敏度:并非所有蛋白-蛋白相互作用都會產生明顯的CETSA位移,因此某些相互作用可能難以檢測。

結構信息:CETSA通常無法提供具體的結構信息,特別是當蛋白質存在多個相互作用對象時。

細胞定位:CETSA無法直接提供藥物在細胞內的具體定位信息,需要結合其他技術進行進一步研究。

 

評論 / 文明上網理性發言
12條評論
全部評論 / 我的評論
最熱 /  最新
全部 3小時前 四川
文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具?,F代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
點贊12
回復
全部
查看更多評論
相關文章

一文詳解掃描電子顯微鏡(SEM)的工作原理及應用技術

2023-10-08

熱重分析(TG-DTG)曲線的幾種解析方法

2023-12-26

接觸角測試(CA)的原理、樣品制備要求及實際應用

2023-11-16

恒電流間歇滴定法GITT的基本原理以及測試教程

2022-08-12

一文詳細介紹he染色的基本原理、實驗步驟及注意事項

2023-11-23

TMA技術的基本概念、應用領域以及實際操作中的要點

2023-12-06

項目推薦/Project
細胞熱轉移實驗(CETSA)

細胞熱轉移實驗(CETSA)

熱門文章/popular

基礎理論丨一文了解XPS(概念、定性定量分析、分析方法、譜線結構)

手把手教你用ChemDraw 畫化學結構式:基礎篇

晶體結構可視化軟件 VESTA使用教程(下篇)

【科研干貨】電化學表征:循環伏安法詳解(上)

電化學實驗基礎之電化學工作站篇 (二)三電極和兩電極體系的搭建 和測試

【科研干貨】電化學表征:循環伏安法詳解(下)

微信掃碼分享文章
主站蜘蛛池模板: 平武县| 获嘉县| 乳源| 达孜县| 柳江县| 晴隆县| 响水县| 屏南县| 金坛市| 临安市| 桃园市| 河北省| 和静县| 乐至县| 桑植县| 苗栗县| 莱州市| 玉环县| 合江县| 深圳市| 新源县| 正阳县| 信阳市| 托克逊县| 万盛区| 阜平县| 肥乡县| 农安县| 永定县| 泸水县| 太和县| 华宁县| 马关县| 西林县| 蒲城县| 英德市| 景东| 蒙山县| 于都县| 无为县| 永宁县|