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項(xiàng)目介紹

慢病毒載體是一類重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，由于其結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)，慢病毒載體作為一種重要的基因轉(zhuǎn)移工具應(yīng)用于基因治療和細(xì)胞分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型細(xì)胞，達(dá)到良好的基因治療效果。

特點(diǎn)：1.大大提高對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、 干細(xì)胞、不分裂的細(xì)胞等轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

2.目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的概率大大增加

3.快速獲得高水平的表達(dá)

4.具有最低的細(xì)胞毒性，將免疫反應(yīng)降到最低

5.能夠插入較大的片段（≈ 3kb）

實(shí)驗(yàn)流程：

制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其三種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，用本公司的轉(zhuǎn)染試劑 RNAi-Mate 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮，得到高滴度的慢病毒濃縮液，用于感染目的細(xì)胞。感染后的目的細(xì)胞可以通過慢病毒載體上的抗性基因和熒光融合蛋白進(jìn)行篩選。

常用慢病毒滴度檢測方法比較：




樣品要求

樣品運(yùn)輸和儲(chǔ)存

對(duì)于長距離運(yùn)輸，應(yīng)先將慢病產(chǎn)品保存在-80℃，再采用全程干冰運(yùn)輸，以防滴度下降。

慢病毒載體在-80℃保存6個(gè)月，滴度不會(huì)明顯下降（保質(zhì)期6個(gè)月）。建議保存6~12個(gè)月以上的樣品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，重新測一次滴度。應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融（小于3次）。

使用前請(qǐng)從-80℃冰箱中取出病毒，冰浴溶解。用不完的病毒可以暫時(shí)放在4℃冰箱中，若當(dāng)天不能用完，請(qǐng)立即存放于-80℃冰箱中。

項(xiàng)目案例
常見問題
1、通常在轉(zhuǎn)移載體中最大能夠插入多大的目的基因序列？

基于 HIV 基因骨架的原因，通常插入的目的基因序列要小于4 kb，否則會(huì)影響病毒滴度甚至基因表達(dá)。

2、慢病毒感染后多久檢測細(xì)胞基因表達(dá)？

慢病毒感染后一般 72~96h 后檢測基因表達(dá)，對(duì)于生長遲緩代謝慢的細(xì)胞，可以適當(dāng)推遲檢測時(shí)間，中途換液保持細(xì)胞的良好狀態(tài)。

3、Lentivirus 對(duì)目的細(xì)胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？

一般，我們通過提高 MOI 值來提高病毒的轉(zhuǎn)染效率，必要時(shí)以在培養(yǎng)基中加入 Polybrene（4~8 μg/mL）來提高病毒的感染效率。同時(shí)，目的細(xì)胞良好的生長狀態(tài)是獲得正常感染效率的保證。

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