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深入解析蛋白質WB實驗:步驟詳解與技巧分享
來源: 時間:2024-07-17 11:41:07 瀏覽:1756次

深入解析蛋白質WB實驗:步驟詳解與技巧分享


蛋白質WB實驗,全稱為蛋白質印跡Western Blot),是一種廣泛應用于生物化學和分子生物學領域的技術,主要用于檢測特定蛋白質在樣本中的表達情況。以下是WB實驗的詳細步驟和關鍵點:

蛋白質免疫印跡WB

1. 實驗準備

溶液與試劑準備:包括裂解緩沖液(如NP-40緩沖液、RIPA緩沖液)、電泳緩沖液、轉膜緩沖液、封閉緩沖液等。這些溶液的配方和準備是實驗成功的關鍵。

 

樣本制備:根據實驗需要,從細胞或組織中提取蛋白質。細胞裂解時,需將細胞培養皿放置在冰上,用冰冷的PBS洗滌細胞后,加入裂解緩沖液。組織裂解則需將組織速凍后勻漿。

2. 蛋白質定量

使用Bradford法或BCA法等對裂解液中的蛋白質進行定量,確保上樣時蛋白質的量一致。

3. 電泳

通過SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離蛋白質。蛋白質在凝膠中根據分子量大小分離。

4. 轉膜

將電泳分離后的蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上。轉膜過程需在轉膜緩沖液中完成。

5. 封閉

轉膜后,使用封閉緩沖液(如含3-5%牛奶或BSATBST緩沖液)封閉膜上的非特異性結合位點。

6. 抗體孵育

用特異性一抗識別目標蛋白,隨后使用標記的二抗進行檢測。這一步驟是WB實驗的核心,抗體的選擇和孵育條件對結果至關重要。

7. 檢測

使用ECL(增強化學發光)等方法顯色,通過X光片或成像系統捕捉信號,分析目標蛋白的表達情況。

 

實驗技巧與注意事項

確保所有試劑和設備均在適當的條件下保存和使用。

裂解過程中要避免蛋白質降解。

電泳和轉膜時,注意控制電流和溫度,以保證蛋白質的有效轉移。

抗體孵育過程中,要注意抗體的工作濃度和孵育時間。

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全部 3小時前 四川
文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具。現代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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