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    蛋白免疫印跡實驗的步驟講解及結果分析
    來源： 時間：2023-09-15 16:30:23 瀏覽：9989次

    蛋白免疫印跡實驗步驟講解及結果分析


    蛋白免疫印跡（Western blot）是一種常用的蛋白質檢測技術，能夠確定目標蛋白的存在、濃度和鑒定其分子量等特征。本文將詳細介紹蛋白免疫印跡實驗的步驟，并提供結果分析的指導。

     

     

     

    實驗步驟：

    一．樣品制備：

    蛋白免疫印跡實驗的第一步是樣品制備。通常，您可以從細胞培養物、動物組織或微生物培養物等樣品中收集蛋白質。在此過程中，您需要避免蛋白質的降解和失活。

    以下是一般的樣品制備步驟：

    a. 收集細胞或組織：使用適當的緩沖液洗滌細胞或組織，以去除雜質和外部污染物。

    b. 細胞破碎：加入蛋白提取緩沖液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），破壞細胞膜和核膜，釋放蛋白質。

    c. 離心：將細胞裂解液或組織裂解液進行離心，去除細胞碎片和核酸等雜質。

    d. 收集上清液：將上清液轉移到新的離心管中，以去除未溶解的固體。

     

    二．蛋白質濃度測定：

    在進行免疫印跡實驗前，您需要確定蛋白質的濃度，以便加載相同的蛋白質量進行電泳分離。有幾種方法可用于測定蛋白質濃度，如BCA法或Bradford法。

    a. BCA法（雙硫鍵還原法）：首先，準備一系列蛋白質標準溶液，使用乙醇胺胸腺嘧啶（BCA）試劑與蛋白質反應，生成可測定光密度的復合物。

    b. Bradford法：該方法使用考馬斯亮藍G-250試劑，該試劑與蛋白質結合形成深藍色物質，測量其吸光度。

     

    三．SDS-PAGE電泳：

    SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種將蛋白質按照分子量大小進行分離的常見方法。以下是簡要的步驟：

    a. 準備凝膠：根據實驗需要選擇合適的聚丙烯酰胺凝膠濃度和孔隙度。通常使用10%至15%的凝膠。

    b. 配制電泳緩沖液：根據實驗室的標準操作程序制備Tris-緩沖溶液，加入適量的SDS和硫酸銨，調整pH值。將電泳緩沖液加入電泳槽中。

    c. 加載樣品：將樣品蛋白質與加載緩沖液混合，加熱至95°C，使之變性。然后，將樣品加載到凝膠孔中。

    d. 電泳：將凝膠浸入電泳槽中，將電泳槽兩端連接到電源，施加適當的電壓使蛋白質沿凝膠電泳。

    e. 停止電泳：當蛋白質移動到合適位置或接近凝膠底部時，停止電泳。

    f. 凝膠染色：使用染色劑（如Coomassie藍染液）對凝膠進行染色，以顯示蛋白質帶狀。

    g. 存儲凝膠：將凝膠轉移到顯影儀或圖像記錄系統中，記錄凝膠圖像以備后續分析使用。

     

    四．轉膜：

    轉膜是將凝膠上的蛋白質遷移到膜上的一個步驟，以便進行抗體的探針檢測。常用的膜材料有聚偏氟乙烯（PVDF）和硝酸纖維素（NC）。以下是轉膜步驟：

    a. 準備膜：切割適當大小的膜，并將其在轉膜緩沖液中濕潤。

    b. 電泳后處理：取出凝膠，將其在轉膜緩沖液中浸泡一段時間（通常為10-15分鐘），使蛋白質遷移到膜上。

    c. 轉膜裝置組裝：將濕潤的膜放在轉膜裝置上，層疊在凝膠上。確保膜與凝膠之間沒有氣泡。

    d. 轉膜操作：將轉膜裝置組裝到轉膜槽中，添加足夠的轉膜緩沖液，使其覆蓋整個膜和凝膠。連接上正負電極，施加適當的電壓，進行轉膜操作。

    e. 轉膜結束：當蛋白質完全轉移到膜上后，停止轉膜操作。取出膜并進行后續的處理。

     

    五．阻斷：

    在進行抗體結合之前，需要對轉膜膜進行阻斷，以避免非特異性結合和減少背景信號。一般會使用牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉作為阻斷劑。以下是阻斷步驟：

    a. 準備阻斷緩沖液：在TBST緩沖液中加入適量的阻斷劑（通常為5%脫脂奶粉或1% BSA）。

    b. 阻斷操作：將轉膜膜放入阻斷緩沖液中，輕輕搖晃，使其完全接觸。

    c. 阻斷時間：通常阻斷操作需要1-2小時，室溫進行。

     

    六．抗體孵育：

    抗體孵育是關鍵步驟之一，用于特異性結合目標蛋白。以下是抗體孵育步驟：

    a. 準備一次抗體：選擇與目標蛋白特異性結合的一次抗體。

    b. 稀釋抗體：根據供應商提供的建議或先前的優化實驗，將抗體稀釋到適當濃度的TBST緩沖液中。

    c. 抗體孵育：將轉膜膜放入含有稀釋抗體的TBST緩沖液中，使其與目標蛋白進行特異性結合。孵育溫度和時間根據抗體的要求進行設定。

    d. 洗滌：在抗體孵育后，將轉膜膜放入TBST緩沖液中進行洗滌，去除非特異性結合的抗體。

     

    七．二次抗體結合及探針檢測：

    在經過一次抗體結合后，通常需要使用與一次抗體相對應的二次抗體進行結合，該二次抗體與一個酶、熒光染料或放射性標記結合，以提供可檢測的信號。

    a. 選擇二次抗體：根據一次抗體的物種來源，選擇相應的二次抗體。

    b. 稀釋二次抗體：根據供應商提供的建議或先前的優化實驗，將二次抗體稀釋到適當濃度的TBST緩沖液中。

    c. 二次抗體結合：將轉膜膜放入含有稀釋二次抗體的TBST緩沖液中，使其與一次抗體進行結合。

    d. 探針檢測：根據二次抗體的標記物，選擇合適的方法進行探針檢測。例如，可以使用酶底物進行著色、熒光探針進行熒光檢測，或者用放射性探針進行放射性測量。

     

    八．圖像獲取及分析：

    使用分析系統（如顯影儀、熒光成像儀或放射性顯像系）獲取轉膜膜上的圖像，并進行后續的分析。以下是常見的圖像分析步驟：

    a. 圖像獲取：將轉膜膜放入相應的圖像獲取系統中，進行圖像記錄。

    b. 圖像分析：使用圖像處理軟件對圖像進行分析，測量蛋白質帶的密度和大小。

    c. 定量分析：通過與適當的內部參考蛋白或總蛋白的相對定量比較，確定目標蛋白的相對表達水平。

     

    結果分析：

    1.信號強度：根據圖像分析的結果，觀察目標蛋白帶在膜上的信號強度。較強的信號表示高蛋白質表達，較弱的信號可能表示低蛋白質表達。

    2.分子量大小：通過與分子量標記品對比，在凝膠上的目標蛋白帶遷移位置來估計其分子量大小。

    3.特異性：確保只有目標蛋白帶出現信號，而其他非特異性結合的蛋白不產生信號。檢查其他帶狀信號是否與預期的目標蛋白大小和形態相符。

    4.負對照和陽性對照：分析實驗中的負對照和陽性對照結果，以驗證實驗方法的有效性和可靠性。

    5.統計學分析：使用適當的統計學方法（如t檢驗或方差分析）對結果進行統計學分析，確定差異的顯著性。

    需要注意的是，蛋白免疫印跡實驗是一種復雜的技術，結果分析需要綜合考慮實驗中的多個因素，并結合之前的研究背景和目的進行解讀，對于結果的進一步分析和解釋，可能需要借助其他實驗或技術的支持。

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    12條評論
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    全部 3小時前 四川
    文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具。現代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字，很多小語種，有語言但沒有文字。文字的不同體現了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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