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    實驗筆記丨免疫組織化學染色(IHC)步驟詳解
    來源: 時間:2022-11-02 15:34:07 瀏覽:3390次

    免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)。


    包埋組織

    在4%多聚甲醛溶液中固定組織48小時后,放入一次性組織包埋盒中脫水,浸蠟后包埋。


    修片


    修剪石蠟切片,直至將石蠟切片修到大部分組織在切面上。

    組化


    3.1 蠟塊制備

    將組織蠟塊提前泡到冰水混合物中使其變軟,將組織蠟塊放在切片機上切出5微米的切片,60°C烘片1小時。


    3.2 脫蠟

    1)將切片放到60°C烘箱中烘片4h以上。

    2)在二甲苯I里置入片子,持續0.5 h,再置于二甲苯II,依然持續0.5 h。


    3.3 水化

    1)通過酒精,浸泡切片,酒精濃度不一,分為70%、80%、90%、95%、100%,各濃度浸泡時間也有所差異,前3個濃度都是各自浸泡2分鐘,后面兩個濃度分別浸泡5分鐘、10分鐘。

    2)最后將片子放到雙蒸水中浸泡2min。


    3.4 組化

    1)封閉處理:選擇內源性過氧化物酶阻斷劑,處理時間為20 min。

    2)用雙蒸水浸泡三次,單次時間5 min。

    3)抗原修復:準備pH=6.0的10 nM檸檬酸抗原修復液400-600 ml,把片子放到里面,用保鮮膜封住燒杯口防止沸騰溢出。之后放到微波爐中用高火加熱10 min。

    4)加熱后用雙蒸水補齊液面,在微波爐中加熱40 min(中低火至解凍之間),每隔10 min用雙蒸水補齊液面。

    5)修復結束后,放到室溫下,使其自然冷卻。

    6)DDW清洗180"之后,通過PBS清洗,3分鐘/次,進行三次。

    7)通過一抗封閉,保持4°C,第二天進行溫度回升,為37°C,然后通過PBS清洗,持續5分鐘。

    8)在其中添加反應增強液,然后孵育,室溫條件,持續20 min,再通過PBS清洗,3分鐘/次,進行三次。

    9)加入增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物,然后孵育,室溫條件,持續20 min,再通過PBS清洗,3分鐘/次,進行三次。

    10)滴加DAB顯色液(現用現配、比例1:19),室溫孵育2-10 min(根據不同的抗體自行選擇染色時間)。用自來水輕輕沖洗掉。

    11)復染:加蘇木精染色50 s。用DDW,3 min,PBS,5min X3次。

    12)脫水:將片子依次浸泡到不同濃度的酒精梯度中:70%,lmin—80%,lmin—90%,1 min—95% I,5min—95% II ,5min—100%I,5min—100% II,5min。

    13)透明:利用二甲苯I、二甲苯 II 進行處理,每次處理持續20 min。

    14)中性樹脂封片,中性樹脂,加蓋玻片(組織部位切勿殘留小氣泡),自然晾干。

    來源:科研日精進

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    12條評論
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    全部 3小時前 四川
    文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具。現代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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