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利用動態光散射 (DLS) 進行單克隆抗體測量?
來源：藥時空 時間：2022-10-26 13:55:31 瀏覽：5254次

動態光散射 (Dynamic light scattering，DLS) 是一種強大的方法，適用于測量生物樣品，尤其是蛋白質和生物聚合物。

蛋白質被用作免疫分析和其他快速診斷、疫苗制造中的主要功能成分，以及廣泛的可注射蛋白質藥物的主要成分。


在這些應用中的每一個中，抗體保持完整和單體是至關重要的。忽視遵循這些嚴格的標準會損害基于抗體的產品的可加工性、活性和穩定性。


充分利用DLS，可以發現蛋白質的聚集，并且可以非常準確地確定單體蛋白質的大小。為了證明這一理論，將對單克隆抗體 (mAb)藥物 進行的聚集研究與針對常見蛋白質血清白蛋白 (BSA) 獲得的結果進行比較。


介紹

DLS 依賴于自由漫射材料，由于布朗運動隨機傳播，將在散射激光中產生快速變化的原理。這些強度波動的時間尺度需要幾十納秒到幾百毫秒。這些變化與粒子的運動直接相關。獲得從激光散射強度產生的信號并將其轉換為自相關函數。這是測量粒度分布的基礎。


許多經常出現的球狀蛋白質的流體動力學尺寸很小。蛋白質單體通常小于10nm，其中許多小至1nm或更小。需要高速相關器來測量這種快速擴散的蛋白質的大小。蛋白質聚集體可以輕松地獲得數百納米或更多的大尺寸。部分聚集蛋白質的標準樣品在流體動力學尺寸上可擴展超過1-2個數量級。在這種情況下，難點在于選擇合適的相關儀器以完全解析這些信號。如下所述，相關器的可配置性對于評估具有挑戰性的異質生物樣品至關重要。


應該注意的是，從DLS獲得的直徑，通常稱為流體動力學直徑(dh)，與擴散系數(Dt)成反比。在DLS中測量的Dt與流體動力學大小dh之間的關系是相反的，由斯托克斯-愛因斯坦方程提供：

Dt=kBT/3πηdh


其中玻爾茲曼常數 (kB)、溫度 (T) 和體積粘度 (η) 都是既定值。這個表達式可以簡化為：

Dt∝1/dh


光散射的慣例是將小散射角表示為前向散射，將大散射角表示為后向散射。反向散射，通常是指遠大于90度的角度，非常常用于測量單體大小的小蛋白質的尺寸。相反，前向散射對較大的物種特別敏感，可用于識別甚至微量聚集蛋白質的存在。對于既定的散射角θ和折射率n，散射矢量q由以下表達式確定：

q=4πn/λosin(θ/2)


已建立的相關函數C(τ)被解卷積為單指數、拉伸指數或指數的總和。此目的的不同元素可分為特征衰減率 Г，通常另外還有多分散指數。該 Г 與平移擴散系數 (Dt)相關聯，如下所示：

Г=Dtq2


對于標準的中等大小的球狀蛋白質，可以看到小至數百s-1和大至50000s-1的衰減率(Г)，這取決于散射角。可配置的相關器布局提高了測量如此廣泛的衰減率的能力。如下圖所示，對于BSA，對于既定大小的粒子，Г線性地受 q2的影響。在最可能的應用中，可以采用單個角度的DLS來求解Dt，從而獲得突出顯示的蛋白質的直徑。常見的 DLS 配置，尤其是臺式儀器，通常具有后向散射、直角和前向散射（θ=173o、90o和 15o）。

作為散射角θ函數的血清白蛋白單體的DLS結果。有效dh=7.5nm。為了使Гvsq2相關性有用，最少需要4-5個散射角。


反向散射可用于確定蛋白質單體的大小。通常，反向散射角有助于測量含有游離蛋白質和聚集蛋白質的樣品。反向散射角減少了較大顆粒方向上的固有強度偏差，否則可能會掩蓋單體蛋白質的散射。


前向散射對聚集極其敏感。與反向散射角相比，極低的角度對大顆粒特別是那些大于1000nm的顆粒極其敏感。盡管前向散射對聚集體的存在極為敏感，但后向散射對于精確確定可能與聚集材料共存的任何小顆粒的大小更有用。

在五個單獨的散射角獲得的相關函數，θ=(30,150° )。二次衰變的存在在兩個最低角度變得明顯。


在反向散射中計算時，血清白蛋白看起來是單體的。如果僅在反向散射角處進行DLS 測量，則很容易將BSA的散射與純單體的散射相混淆。在最小的角度（30和45度），第二次衰變的存在是顯而易見的。向較慢擴散方向的轉變，或較小的Г，表明存在較大的粒子。這表明大而緩慢移動的粒子，可以想象聚集的蛋白質，需要與單體蛋白質共存。


BSA是一種傳統的血清蛋白，經常被用作與藥物相關的蛋白質（如抗體）的替代品。這種小的球狀蛋白質以單體、二聚體和有時三聚體的形式存在。在生理pH值下，可能會出現極少量的BSA聚集。相比之下，抗體是大而適應性強的蛋白質，具有緊湊的亞基，由許多脆弱的內部二硫鍵結合在一起。化學降解的抗體可能會聚集或產生低分子量的抗體片段。


可以使用單個角度簡單地測量單體mAb。如下所示，可以在單個散射角θ=90度下有效地測量穩定的單體單克隆抗體。該測量產生大約12nm的有效直徑，以及接近零的低多分散性。相關函數最好定義為單個指數衰減，這意味著樣本的特征簡單且均勻，沒有注意到聚集。

以90度散射角測量的稀釋單克隆抗體顯示單個有效直徑約為11.6nm。

化學應激單克隆抗體的DLS產生與2-3個主要成分的相關函數，其中主要成分是聚集蛋白。


該樣品（上圖）顯然由許多離散且定義明確的群體組成，正如對由聚集蛋白和游離蛋白組合組成的樣品所預期的那樣。相比之下，化學應激抗體不能以由單一衰減常數組成的模型為特征，也不能被顯著標記為連續分布的粒徑。由于這些Г在s-1中跨越多個數量級，因此它們只能通過謹慎選擇包含各種延遲時間（高速、中速和低速通道）的相關器布局來解決。


當采用多峰粒徑分布時，只要采用適當的散射角 (θ≥90度) ，游離單體抗體峰就可以從聚集峰中完全分離出來。很明顯，選擇大的散射角（下圖）增強了解決許多快速衰減的能力。

作為散射角θ和散射矢量q2的函數的多峰分布的可分辨性。


考慮選擇由各種延遲時間(τ)和散射角組成的相關器布局，即使存在極度聚集的蛋白質，也可以極其精確地測量單體mAb。應注意Г1,Г2,Г3在15與155度的分辨率上的差異。


回顧

1、選擇最佳散射角對于準確測量具有挑戰性的生物樣品至關重要。

2、恒定的多角度測量可能會有所幫助，特別是當開始時聚合和單體蛋白質的未確定組合。盡管如此，這對于可靠、均質的蛋白質樣品來說通常是不必要的。

3、應該注意的是，前向散射表示非常小的角度，而后向散射表示大角度。臺式儀器通常具有三個固定的散射角，前向、直角和后向散射。

4、關鍵點：

（1）背向散射有助于小顆粒或混合物的高精度測量。

（2）低角度對較大的顆粒極為敏感；這就是前向散射有助于識別甚至少量蛋白質聚集體的原因。

（3）前向散射角雖然有助于識別聚集，但在量化許多共存物種的大小時不太有用。


結論

蛋白質聚集體可以很容易地達到數百納米或更大的大尺寸，這使本已困難的測量變得復雜。這一原理通過一種適用于藥學的蛋白質、單克隆抗體(mAb) 展示，在其單體和聚集狀態下進行檢查。盡管它具有異質性，考慮到相關器布局和散射角的選擇允許來自單體mAb的信號的全分辨率，盡管存在化學誘導的聚集體。

來源：藥時空

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全部 3小時前 四川
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