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電子順磁共振波譜儀（上）：儀器原理與應用

來源：測試GO 時間：2021-01-21 18:10:08 瀏覽：17550次

1引言

1895年，荷蘭物理學家Zeeman發現在磁場的作用下，光譜的譜線產生分裂，且譜線分裂程度與磁場強度相關的現象，稱為“Zeeman效應”[1]。

2發展歷史

圖1

電子順磁共振(Electronparamagneticresonance,EPR)技術是利用未成對電子對順磁性物質進行化學結構信息分析的波譜學檢測法。EPR技術發源于物理學研究，最初用來研究某些復雜原子的電子結構、原子偶極矩與分子結構、晶體結構等問題，后來延伸到了生物化學領域中對有機化合物的分析表征。目前，EPR測試技術已在物理學、化學、生物學、醫學、能源科學等許多領域得到廣泛應用。值得一提的是，EPR能在不影響反應的前提下，獲取正在進行的物理和化學反應中的物質結構信息和動態信息，是一種有效的原位機理解析手段。

1925年，Uhlenbeck等提出電子的磁矩是由電子的自旋運動貢獻的。

1945年，Frenkel及其合作者在使用133MHz的交變電磁波照射CuCl2·2H2O樣品時檢測到了電磁波被共振吸收的信號，從此宣告了“電子磁共振”的誕生。并證明了更高的微波頻率和更高的外磁場條件更有利于檢測到EPR信號。

1946年，美國哈佛大學的Purcell等在實驗室中觀測到了“核磁共振”(Nuclearmagneticresonance,NMR)現象。

1952年，Hutchison采用EPR技術獲得了第一個有機自由基的波譜結果，是首次將EPR技術應用在非物理學領域，并引起了化學家、生物學家和醫學家的廣泛關注。

20世紀50年代，磁共振譜儀得到了極其快速的發展。60年代末，由于低溫技術、原位檢測和自旋捕捉等新型實驗技術的發展，磁共振譜儀的儀器結構得到了極大的改良和發展，應用范圍得到進一步拓廣。

3理論基礎

3.1磁共振原理

原子中的電子能進行兩種運動：一種是圍繞原子核的軌道運動，一種是圍繞通過其中心的軸所作的自旋運動，兩種運動分別產生軌道磁矩和自旋磁矩。當自由電子處于外加磁場B0中時，與外加磁場的相互作用將使電子的自旋能級從簡并態分裂為兩個能級，這就是電子自旋磁矩在外磁場中能量的塞曼分裂（Zeemansplitting）。如下圖2所示。

圖2

3.2吸收-弛豫-吸收過程

圖3

3.3場調制

最廣泛使用的連續調波EPR光譜的結果通常是表現測量吸收信號的一次微分值的譜線，這一過程是依靠一個外加的高頻調制場來將吸收信號解析出來的。調制線圈纏繞在諧振腔的外側，使產生的調制磁場方向與外加磁場一致。在慢速掃描的主磁場上再疊加一個高頻、低幅的調制磁場，調制頻率一般為100kHz。通過相敏檢波器檢測峰間幅值，可以獲得到吸收信號的一次導數信號。

圖4

由于這種場調制的方法使用了相敏檢波器，僅有相同頻率調制的信號（100kHz）可被檢測到，這種采用了高頻調制和相敏檢波的檢測方法能夠顯著提高信噪比。為了進一步提高儀器的分辨率，現代波譜儀還能觀測二次微分曲線形式的測量結果。

4儀器結構

電子順磁共振波譜儀主要由微波橋、電磁鐵系統、傳導系統、微波諧振腔、檢測系統、調制系統構成。

微波橋：微波橋由產生、控制和檢測微波輻射的器件組成。微波頻率一般為1≤ν≤100GHz。常用的微波源有速調管和耿氏二極管。速調管在波譜儀中廣泛作為微波源被使用，具有穩定、高能、噪聲低的優勢，能有效提高儀器分辨率。微波源后緊接著一個隔離調制器，用于減弱反射回源，維持微波頻率的穩定。

圖5

電磁鐵系統：EPR光譜儀中的電磁鐵系統要求能夠提供強度符合需要的、穩定的、均勻的磁場，磁性組件包括磁體和磁場傳感器。EPR光譜儀使用的磁體主要有兩種：第一種是電磁體，通常能夠產生高達1.5T的場強，適合在Q波段頻率進行測量。第二種是超導磁體，適用于W波段和更高頻率下進行操作。根據工作微波頻率協調所需的磁場強度范圍，從而進行磁體種類的選取。

傳導系統：傳導系統負責將產生的微波傳導到指定位置，由隔離器、衰減器、環形器、波導管等重要器件連接而成。產生于微波源的電磁波通過定向耦合器被分成兩條路徑：一條路徑指向諧振空腔，另一條路徑指向參考臂。在兩個路徑上都有一個可變衰減器，能夠精確控制產生微波的功率。在諧振空腔路徑上，微波與樣品相互作用，產生用于分析的共振吸收信號。在參考臂上，可變衰減器之后有一個移相器，可在參考信號和反射信號之間設定相位關系。

諧振腔：諧振腔好比EPR譜儀的心臟，它是一種方形或圓柱狀的金屬盒，用于放置樣品、產生信號、放大信號、檢測信號。樣品放置在諧振腔中，產生的微弱信號在諧振腔內部通過共振被進一步放大，當能級分裂接近于入射微波光子的頻率時，就能夠通過固態二極管檢測得出吸收線。諧振腔存儲微波能量的能力由品質因數Q給出，Q值越高，光譜儀的靈敏度越高。

檢測系統：載有信號的微波經環形器被傳導出諧振腔，先經過檢波后進入100kHz窄頻帶放大器，隨后進入相敏檢波器，在這里只檢出與參考信號的頻率與相位都相同的接收信號。相敏檢波器輸出的信號經過放大后送入電腦。

調制系統：大多數外部元件，如微波源發生器和檢測器等都包含在微波橋接控制中，通過調制系統控制輸入及輸出的微波頻率。調制系統的作用在于降低噪聲、提高譜儀靈敏度。

4.1儀器工作原理

在EPR儀器中，電磁鐵系統產生的磁場與經波導管傳導至諧振腔的電磁波相互垂直，也與掃描線圈互相垂直。當電磁波的頻率ν0和磁場強度H0滿足共振吸收條件時，放置在諧振腔中的樣品就要發生共振而吸收能量。吸收信號在諧振腔中被放大后，經過相敏檢出放大后即可顯示于示波器上，并被記錄儀自動記錄下來。

4.2制樣要求

（1）氣體樣品的制備：

常見的氣體樣品如測試香煙中的自由基含量，主要的制樣手段是對煙氣進行富集，以達到測試需求的測試濃度。

（2）液體樣品的制備：

①溶劑選擇：對于極性大的溶劑，要將樣品放在毛細管中進行測試，以避免溶劑對微波的吸收；

②除氧操作：液體中的氧氣對信號的干擾非常大，因此需要對樣品進行通氮或者真空除氧，以保證測試過程中能看到精細的結構信息；

未除氧

除氧

圖6

③濃度控制：濃度過大或過小都會對樣品信號造成干擾，導致精細結構的丟失，因此選擇適當的濃度對測試結果有幫助。

（3）固體樣品的制備：

①除潮處理：保護EPR圖譜細節不受影響；

②樣品粒徑：要注意固體樣品的顆粒大小，以免堵塞送樣管；

③稀釋操作：粉末樣品的順磁濃度如果太大也會對信號造成干擾，可以采用干燥硅膠或碳酸鈣進行固體稀釋。

（1）溫度作用：溫度對信號的影響主要體現在兩個方面，一是熱擾動對測試結果造成干擾；二是高溫信號的存活時間較短，難以捕捉。因此一些諸如固體表面空穴檢測、過渡金屬的不穩定價態測試等都需要在液氮的低溫環境中才能較好的采集到信號。

（2）樣品濃度：樣品濃度過高時分子間的距離較近，會使電子自旋-自旋相互作用更強，影響儀器分辨率；過低會接近儀器檢出限，影響結果的靈敏度。因此需要采用分散劑，對樣品濃度進行合適的調整。

圖6不同干燥手法對EPR波譜的影響

圖7

4.3影響因素

（3）磁場調制：磁場調制幅度過大或頻率與譜線過于接近時會影響檢波器的輸出信號，引起譜線畸變失真。

（4）樣品種類：確定樣品種類及順磁中心性質對調整微波頻率與磁場場強有著重要的參考價值。比如水溶液中的樣品，尤其是生物樣品，主要通過介電過程吸收微波，而介電損耗在很大程度上受到頻率的影響，因此為了保證能夠有效觀測到EPR信號，需要選擇較低的微波頻率。

5應用

EPR技術起源于物理學研究，但只要能在樣品中形成未成對電子就能加以研究，其應用幾乎遍及一切材料。

5.1蛋白質結構變化分析

在生物過程中存在著大量的自由基問題，如植物的光合作用、金屬蛋白質的催化過程等。因此，電子順磁共振波譜技術是在分子及細胞水平上研究生物醫學問題的關鍵工具。由于蛋白質的結構與功能密切相關，當蛋白質進行生物學活動時，其構象就發生改變，因此可以通過研究蛋白質結構的變化對生物學過程進行分析。

圖8

在采用EPR技術對生物學蛋白質大分子結構解析的過程中，可以采用自旋標記技術，逐點定位標記自由基，獲取一系列EPR譜圖，從譜圖分析獲取其二維結構，再輔以長程約束手段，最終獲取完整的蛋白質結構信息。在此基礎上，可以定點將標記探針引入感興趣的位點，在不干擾蛋白質結構及功能的前提下，追蹤蛋白質在生物活動中發生的構象改變。

AliseR.Muok等[6]就是根據上述實驗思路，采用β修飾的二磷酸腺苷作為自旋標記探針，通過研究標記物側鏈的動力學信息，對反應蛋白標記位點的周圍環境和空間變化進行了研究。并且證實采用β修飾得到的ADP-β-S-SL是一種有效的進行雙電子電子共振（DEER）光譜實驗的探針工具。

5.2原位電化學過程研究

EPR光譜技術的一大特點是可在不影響物理、化學、生物反應過程的前提下對樣品進行表征，因此具有原位表征的潛力。英國曼徹斯特大學的王斌等人[7]應用EPR技術對活性炭在水溶液中的電化學電容儲存過程進行了原位檢測。

實驗結果表明，EPR信號強度和雙積分值都隨著充電過程而增加，隨后在放電過程中可逆的恢復。

此外，綜合EPR光譜線形及其溫度依賴性分析得知，在活性炭的雙電容行為中存在兩種自旋行為：缺陷處的自旋，產生窄信號；表面芳族自旋，形成寬信號。在每種電解質溶液中都能夠看到窄信號的電勢依賴性響應，而寬信號的變化僅在較高濃度下發生。結果表明，窄信號的增加是由于官能團還原形成自由基，引起了未成對電子密度增加，寬信號的電勢依賴性可能與離子進一步吸附到活性炭的深層多孔結構中有關。

圖9

6新式儀器種類

傳統EPR儀器采用的是固定微波頻率、掃描磁場的方法，稱為連續波-EPR（CW-EPR,continuouswave-EPR）儀器。近些年，隨著附加器件的開發，發展出了脈沖-EPR和快速掃描-EPR技術，使EPR技術進入了多樣化領域，能夠獲得更加多樣的信息，樣品測量范圍進一步擴大。

6.1脈沖-EPR

脈沖波激發EPR技術實際上是一種弛豫測量工具，在脈沖波的激發下，自旋體系的弛豫現象被放大，能夠提供有別于連續波激發共振的信息。

脈沖技術的實現只需對微波源器件進行簡單的附件添加和調整。在微波源設置脈沖程序控制開關，就可以輸出具有一定間隔的脈沖微波。脈沖EPR擁有多頻、多共振和任意波形模式。脈沖-EPR的優勢在于：能夠提高g因子分辨率；放大微波功率；使用脈沖微波激發的共振躍遷信號無需經過磁場調制就能進行檢測；改變激發電磁波的脈沖序列，可以獲得有關順磁化合物的更廣泛信息。但與CW-EPR相比，脈沖-EPR無法激發得到整個光譜信息，且由于帶寬更大，靈敏度受到限制。

圖10

6.2快速掃描-EPR

快速掃描-EPR（RS-EPR,rapidscanning-EPR）技術結合了CW-EPR和脈沖-EPR的發聲原理，更適合用于研究快速反應動力學。在快速掃描-EPR時，磁場在比電子自旋弛豫時間更短的時間內對樣品進行共振掃描。

快速掃描信號的優勢在于能夠提供全譜檢測，并且適用于在不飽和情況下提供更高的微波功率，尤其適合低頻EPR成像；快速掃描EPR波譜能夠同時測量自旋系統響應吸收和色散分量，可以顯著提高信噪比。

與脈沖-EPR相比，快速掃描-EPR具有更高的靈敏度、更佳的空間分辨率、更短的采集時間，并能在單位時間內進行更多的臨床前成像測量，這種技術對于進行臨床體內研究尤其重要。

7展望

電子順磁共振波譜是針對順磁性物體進行結構分析與反應過程解析的有力表征方式，即使樣品中不存在順磁中心，也能夠采用人工方法形成未成對電子，因此適用于廣泛的樣品種類。而且隨著外加附件的研究與發展，電子順磁共振技術的表征手段更加多樣化，應用范圍進一步拓寬。更重要的是，它是一門有效的原位表征技術，因此在研究致癌機理、臨床反應、催化原理等過程及其中間產物問題時具有強大的分析能力。綜上所述，電子順磁共振波譜在生物醫學、電化學等領域具有無窮的應用潛力。

參考文獻

[1]L.R.Nobellectures,Physics:1901–1921(ElsevierPublishingCompany,Amsterdam,1967.500p.80guilders)[J].NuclearPhysicsA,1969,130(3):696-696.

[2]https://en.wikipedia.org/wiki/Zeeman_effect

[3]ProsserKE,WalsbyCJ.ElectronParamagneticResonanceasaToolforStudyingtheMechanismsofParamagneticAnticancerMetallodrugs[J].EuropeanJournalofInorganicChemistry,2016,2017.

[4]https://en.wikipedia.org/wiki/Electron_paramagnetic_resonance

[5]WilfredRaymondHagen.BiomolecularEPRspectroscopy[J].BiomolecularEprSpectroscopy,2014.

[6]MuokAR,ChuaTK,LeH,etal.NucleotideSpinLabelingforESRSpectroscopyofATP-BindingProteins[J].APPLIEDMAGNETICRESONANCE,2018.

[7]WangB,FieldingAJ,DryfeRAW.Insituelectrochemicalelectronparamagneticresonancespectroscopyasatooltoprobeelectricaldoublelayercapacitance[J].ChemicalCommunications,2018,54(31).

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